方案編號：KDN-004

適用儀器：全自動凱氏定氮儀、石墨消化爐

發(fā)布日期：2026年l0月9日

1  前言

蛋白質(zhì)是膠原蛋白類生物材料的關(guān)鍵質(zhì)量指標(biāo)，重組 Ⅲ  型人源化膠原蛋白作為重要的生物醫(yī)用材料，其蛋白質(zhì)含量是衡量產(chǎn)品純度與批次一致性的核心參數(shù)之一。我國相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)對重組膠原蛋白類產(chǎn)品（如醫(yī)療器械、生物敷料、化妝品原料等）均有明確的蛋白質(zhì)含量要求，準(zhǔn)確測定凍干纖維狀膠原蛋白中的蛋白質(zhì)含量對產(chǎn)品研發(fā)、質(zhì)量控制及注冊申報具有重要意義。

本方案依據(jù)《GB 5009.5-2025  食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測定》中第一法凱氏定氮法的全自動凱氏定氮儀法（5.2  節(jié)），采用全自動凱氏定氮儀配合石墨消化爐進(jìn)行測定。該方法將消解與檢測流程無縫銜接：樣品在石墨消化爐中消化后，消化管直接轉(zhuǎn)移至凱氏定氮儀，由儀器自動完成蒸餾、滴定及結(jié)果計算，具有自動化程度高、結(jié)果準(zhǔn)確、重復(fù)性好的特點，適用于重組Ⅲ型人源化膠原蛋白（凍干纖維狀）及其他高蛋白生物材料中蛋白質(zhì)的批量檢測。

2  儀器與試劑

2.1  儀器

全自動凱氏定氮儀（配有滴定系統(tǒng)、蒸餾系統(tǒng)，可直接對消化管進(jìn)行蒸餾滴定），石墨消化爐（控溫精度 ±l℃ , 最高溫度 ≥420℃) , 分析天平（感量 0.00l g），消化管（與消化爐和定氮儀配套），移液管、量筒等玻璃器皿，剪刀或研磨工具（用于凍干纖維狀樣品的預(yù)處理）。

圖l 全自動凱氏定氮儀及石墨消化爐外觀圖

2.2  試劑

硫酸銅（CuSO? ·5H2O），硫酸鉀（K2SO?) , 硫酸（H2SO? , 98%），（NaOH），硼酸（H3BO3），硫酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液 [c(l/2H2SO4)=0. l mol/L] ，甲基紅指示劑（l g/L 乙醇溶液），溴甲酚綠指示劑（l g/L 乙醇溶液），混合指示劑 B：l 份甲基紅乙醇溶液與5 份溴甲酚綠乙醇溶液混勻，水：符合 GB/T 6682  規(guī)定的三級水。

試劑選擇說明：人源化膠原蛋白凍干纖維蛋白質(zhì)含量高（通常 ≥90%），建議使用 0.1 mol/L硫酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液進(jìn)行滴定。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)含量 ≤1 g/100 g 時可選用 0.05 mol/L  溶液。

3  實驗方法

3.1  試樣制備

取具有代表性的重組 Ⅲ  型人源化膠原蛋白凍干纖維樣品，用剪刀剪碎或研磨成均勻粉末狀，充分混勻后裝入密閉容器中備用。凍干纖維狀樣品易吸潮，制備過程應(yīng)盡量快速，避免長時間暴露于空氣中。

3.2  試樣稱量與消解

準(zhǔn)確稱取粉碎后的膠原蛋白試樣約 0.1 g（精確至 0.001 g），置于干燥的消化管中。依次加入：硫酸銅 0.4 g ，硫酸鉀 6 g ，硫酸 15 mL。

輕輕搖勻，將消化管置于石墨消化爐上。啟動消解程序， 420℃恒溫消解至少 1～1.5h ，直至消解液呈藍(lán)綠色透明狀，確保消解。

消解結(jié)束后，取下消化管冷卻至室溫。無需轉(zhuǎn)移消解液，消化管可直接用于后續(xù)蒸餾滴定。同時進(jìn)行空白試驗（不加樣品，其余步驟相同）。

 圖2石墨消化爐消解過程圖

3.3  蒸餾與滴定

開機(jī)預(yù)熱全自動凱氏定氮儀，檢查堿液（NaOH溶液）、吸收液（硼酸溶液+混合指示劑 B）、滴定液（硫酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液）是否充足。

將含有消解液的消化管（包括試樣和空白）依次放入定氮儀的樣品盤上。

根據(jù)儀器操作說明，設(shè)置蒸餾滴定參數(shù)（如加堿量、蒸餾時間、接收液體積等）。儀器將自動加入NaOH溶液堿化蒸餾（加堿量根據(jù)消解用酸量設(shè)定，通常為酸體積的 4 倍）進(jìn)行堿化蒸餾，釋放的氨被硼酸吸收，然后用硫酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液自動滴定至終點（混合指示劑 B 由藍(lán)綠色變?yōu)闇\灰紅色）。

儀器自動記錄滴定體積并計算蛋白質(zhì)含量。分別記錄試樣消耗體積 V1 和空白消耗體積 V0。

 圖3滴定參數(shù)設(shè)置界面及全自動凱氏定氮儀工作圖片

4  結(jié)果與討論

4.1  計算公式

試樣中蛋白質(zhì)含量按下式計算（適用于全量蒸餾，即全部消解液用于蒸餾）：

式中：

X  —— 試樣中蛋白質(zhì)含量，單位為克每百克（g/100 g）

V1   —— 滴定試樣消解液消耗硫酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的體積，單位為毫升（mL）

V0   —— 滴定空白消解液消耗硫酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的體積，單位為毫升（mL）

C  —— 硫酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的濃度，單位為摩爾每升（mol/L），此處為 c(1/2H2SO4)

0.0140  —— 與 1.00 mL 硫酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液 [c(1/2H2SO4)= 1.000 mol/L]相當(dāng)?shù)牡馁|(zhì)量，單位為克每毫摩爾（g/mmol）

M —— 試樣質(zhì)量，單位為克（g）

F —— 蛋白質(zhì)折算系數(shù)（重組Ⅲ型膠原蛋白取 5.325）

100  —— 換算為每百克試樣的系數(shù)

注：全自動凱氏定氮儀內(nèi)置上述計算公式，可直接讀取蛋白質(zhì)含量結(jié)果。

4.2  測試結(jié)果

注 1 ：硫酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液濃度 c = 0. 1129 mol/L；V0:0.08 mL。

注 2 ：蛋白質(zhì)折算系數(shù) F = 5.325 ，結(jié)果保留三位有效數(shù)字。

 圖4檢測結(jié)果截圖

4.3  精密度

在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果的絕對差值不得超過算術(shù)平均值的 5%（因蛋白質(zhì)含量 > 10 g/100 g），符合 GB 5009.5-2025 標(biāo)準(zhǔn)要求。

5  方案特點與優(yōu)勢

5.1  針對膠原蛋白凍干纖維樣品的方法優(yōu)勢

樣品代表性：凍干纖維狀樣品經(jīng)剪碎或研磨確保均勻，避免纖維粗細(xì)差異導(dǎo)致消化不好。

消解高效：石墨消化爐溫控精準(zhǔn)，420℃  恒溫消解保證膠原蛋白中蛋白質(zhì)分解。

流程簡化：消解后直接上機(jī)，無需轉(zhuǎn)移定容，減少操作步驟和人為誤差。

5.2  儀器設(shè)備優(yōu)勢

石墨消化爐：加熱均勻、升溫快、耐腐蝕，可同時處理多批樣品，提高效率。

全自動凱氏定氮儀： 自動化完成加堿、蒸餾、滴定、計算，結(jié)果直接讀取，數(shù)據(jù)可存儲導(dǎo)出，符合現(xiàn)代實驗室對智能化、可追溯的要求。

5.3  關(guān)鍵操作要點

樣品粉碎：凍干纖維狀樣品必須剪碎或研磨，防止纖維纏繞或顆粒不均勻?qū)е孪瘯r間延長或消化不好。消解終點判斷：消解液應(yīng)呈藍(lán)綠色透明狀，且加熱至少 1 h，確保氮釋放。

堿液添加量：加堿量應(yīng)根據(jù)消解時加入的硫酸量確定。通常堿液（40% NaOH）的添加量應(yīng)為消解用濃硫酸體積的 4 倍左右，以確保中和硫酸并使溶液呈強(qiáng)堿性。

堿量是否充足的判斷：可通過觀察反應(yīng)液顏色變化來判斷。硫酸銅在堿性條件下會生成褐色沉淀（氧化銅），若蒸餾時溶液顏色未發(fā)生變化，說明堿液添加量不足，需要補(bǔ)加。

空白控制：空白值應(yīng)穩(wěn)定且低（通常 V0<0.2 mL），若偏高需檢查試劑純度、消化管清潔度或蒸餾系統(tǒng)密封性。

滴定液濃度：定期標(biāo)定硫酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液，確保濃度準(zhǔn)確；注意使用與濃度匹配的滴定管精度。

折算系數(shù)：大豆蛋白質(zhì)折算系數(shù)為 6.25 ，若檢測大豆制品（如大豆分離蛋白）應(yīng)參照產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行。

6  結(jié)論

本方案采用全自動凱氏定氮儀配合石墨消化爐，建立了大豆中蛋白質(zhì)含量的測定方法。方法嚴(yán)格遵循 GB 5009.5-2025 國家標(biāo)準(zhǔn)，消解與檢測無縫銜接，操作簡便、結(jié)果準(zhǔn)確可靠，適用于大豆原料、豆制品及飼料等樣品的批量檢測，可為育種、收購、加工及質(zhì)量控制提供有力支持。

7  參考文獻(xiàn)

[1] GB 5009.5-2025  食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測定[S].

[2] GB/T 601  化學(xué)試劑 標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的制備[S].

 本文檔為通用技術(shù)方案，具體儀器操作請參考對應(yīng)設(shè)備說明書。